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    如何科學正確地使用凍存管呢?
    發布時間:2020-11-23瀏覽:1160次

      如何科學正確地使用凍存管呢?

      凍存管的使用是一門學問,并不是打開液氮罐、放入凍存管、關上液氮罐這樣簡單的三部曲可以完成的??茖W正確地使用凍存管,可以避免樣本的損失,并保護試驗人員的安全。

      凍存管有IATA航空運輸協會標準測試證書,常規儲存細胞培養物,組織樣品,微生物樣品(如病毒,細菌,酵母,真菌,孢子等),人源或動物源其它生物樣品(如血液,血清,精液,抗體,RNA, DNA和蛋白樣本),不適合存儲再生醫學樣本。

      冷凍步驟:

      用預熱的PBS溶液洗滌細胞,吸取溶液,含有胰蛋白酶和EDTA的溶液覆蓋細胞(薄薄的液層足夠,胰蛋白酶和EDTA的濃度需要根據細胞系確定)。

      37℃孵育細胞3-5分鐘。

      細胞從底部脫離之后,終止孵育,加入含有血清的培養基,用移液器輕輕地懸浮細胞。

      離心細胞懸液(500 x g, 5分鐘),用含有血清的培養基重新懸浮。

      細胞計數。

      離心細胞懸液(500 x g, 5分鐘),去除上清液,用適量體積的含有血清的培養基重新懸浮細胞。

      以1:1體積比混合細胞和凍存液(60%培養基,20%胎牛血清,20% DMSO),然后轉移到凍存管中。凍存的細胞密度為 1-5×106 個/毫升。

      含有細胞的凍存管建議以−1 K / min 的速率降溫,可以將凍存管置于−70℃含有異丙醇的容器中。如果凍存管存儲其他樣品,可以直接放置在−20℃,−70℃或者液氮的氣相。為了確保樣品冷凍均勻,4 mL和5 mL的凍存管需要先置于在−20℃冰箱過夜,然后再轉移到−70℃或者液氮的氣相。

      然后轉移凍存管到液氮罐。為了避免污染(如支原體)和安全考慮,請將凍存管置于液氮的氣相,切勿置于液相。

      解凍步驟:

      從液氮罐取出凍存的細胞后立即置于37℃水浴搖晃Cryo.sTM凍存管1-2分鐘。解凍過程需要越快越好。

      轉移解凍的細胞于15 mL離心管,立即用大量的含有血清的細胞培養基混勻。

      500 x g離心細胞5 分鐘,去除上清液,用適量的含有血清的細胞培養基重新懸浮細胞,然后轉移到細胞培養瓶。

      按照建議的細胞濃度接種。

      接下來的12小時細胞進入靜默期。

      間隔24小時和48小時更換培養基

      如果細胞感染了病毒,也可以參考以上步驟進行冷凍存儲和解凍的操作。

      凍存管安全操作建議

      凍存管用來存儲樣品,只能置于液氮氣相或冰箱。禁止凍存管浸沒于液氮液相,否則液氮可能滲入凍存管。因此,解凍時,蒸發的液氮產生高壓力,終導致凍存管炸裂,并且還將導致感染物質釋放。

      因此,操作凍存管時需要佩戴合適的個人安全防護措施,如穿戴安全護服、佩戴護目鏡、在安全櫥操作。

      進行冷凍保存時,凍存管需要緩慢地降溫至冷凍溫度。如果不是緩慢地降溫到冷凍溫度,將導致冰塞形成(如在凍存管頂部),冰塞將阻礙液體形成凝固,將導致高壓力危險和后續的爆管風險。

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